cerdo1

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13539 (2023) Citar este artículo

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Trichosporon asahii es un hongo patógeno oportunista que causa infecciones graves y en ocasiones mortales en pacientes inmunocomprometidos. Hog1, una proteína quinasa activada por mitógenos, regula la resistencia al estrés de algunos hongos patógenos; sin embargo, no se ha investigado su papel en T. asahii. Aquí, demostramos que el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 es sensible a las altas temperaturas, al estrés de la membrana celular, al estrés oxidativo y a los fármacos antifúngicos. El crecimiento del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 se retrasó a 40 °C. El mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 también mostró sensibilidad al dodecilsulfato de sodio, peróxido de hidrógeno, menadiona, metanosulfonato de metilo, exposición a los rayos UV y fármacos antimicóticos como la anfotericina B en condiciones ricas en glucosa. En condiciones de restricción de glucosa, el mutante deficiente en el gen hog1 mostró sensibilidad al NaCl y al KCl. Se atenuó la virulencia del mutante deficiente en el gen hog1 contra los gusanos de seda. Además, la viabilidad del mutante deficiente en el gen hog1 disminuyó en la hemolinfa del gusano de seda. Estos fenotipos se restauraron reintroduciendo el gen hog1 en el mutante con deficiencia genética. Nuestros hallazgos sugieren que Hog1 desempeña un papel fundamental en la regulación de las respuestas al estrés celular en T. asahii.

El hongo patógeno Trichosporon asahii es una levadura basidiomiceto que a menudo se aísla del suelo, sangre humana, esputo, piel, heces y orina1,2,3,4,5,6. T. asahii causa infecciones fúngicas graves en pacientes inmunocomprometidos7,8, y la tasa de mortalidad de las micosis profundas causadas por T. asahii es mayor que la de las infecciones causadas por Candida albicans, otro hongo patógeno (80% frente a 40%)9. La micafungina, un fármaco antifúngico de equinocandina, se usa para tratar a pacientes con sospecha de infecciones fúngicas. Si las infecciones son causadas por T. asahii, se desarrollan infecciones graves porque T. asahii es tolerante a la micafungina10,11. También se han aislado de pacientes cepas de T. asahii resistentes a anfotericina B y a azoles12,13. Por lo tanto, las infecciones causadas por T. asahii son problemáticas en entornos clínicos8.

La vía de señalización mediada por Hog1 está implicada en la resistencia de los hongos a varios tipos de factores estresantes14,15,16. La proteína Hog1, una proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), se traslada del citoplasma al núcleo en respuesta al estrés ambiental y actúa en conjunto con múltiples factores de transcripción para regular la expresión de genes relacionados con la resistencia al estrés15,16. La resistencia al estrés mediada por Hog1 y la regulación genética también afectan la virulencia del hongo patógeno Cryptococcus neoformans17,18,19. La proteína Hog1 también participa en la patogenicidad de C. albicans para el huésped al aumentar su resistencia a diversos factores estresantes y controlar el cambio morfológico de levadura a micelio20,21,22,23,24. Además, los sistemas de respuesta al estrés están relacionados con cambios morfológicos en C. albicans25,26,27,28. Sin embargo, aún se desconoce el papel de Hog1 en la tolerancia al estrés y la virulencia de T. asahii.

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la virulencia de T. asahii, se establecieron un modelo de infección por gusanos de seda y un método para construir un mutante de T. asahii con genes deficientes29,30. El uso de un modelo de gusano de seda invertebrado para experimentos de infección es muy ventajoso porque criar gusanos de seda en grandes cantidades es menos costoso y hay menos problemas éticos asociados con su uso31,32. La virulencia de los aislados clínicos de T. asahii se puede evaluar cuantitativamente calculando la dosis letal media máxima (LD50), que es la dosis de un patógeno necesaria para matar a la mitad de los animales de un grupo29. Se desarrolló un sistema eficiente de selección de genes para generar mutantes de T. asahii con deficiencia genética30,33. Los mutantes de calcineurina de T. asahii con deficiencia genética, una fosfatasa activada por calmodulina cálcica, exhiben una virulencia disminuida contra los gusanos de seda34. Estos hallazgos demuestran que un sistema de evaluación que comprende un modelo de infección por gusanos de seda y un sistema de manipulación genética es útil para dilucidar los mecanismos moleculares de la infección por T. asahii.

En el presente estudio, generamos un mutante de T. asahii deficiente en el gen hog1 y caracterizamos los fenotipos relacionados con la resistencia al estrés y la virulencia en un modelo de infección por gusanos de seda. El mutante deficiente en el gen hog1 mostró sensibilidad a compuestos que se sabe que causan daño a la membrana y a medicamentos antimicóticos. Además, disminuyó la virulencia del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 contra los gusanos de seda. Nuestros hallazgos sugieren que la virulencia y las respuestas al estrés celular de T. asahii están controladas por la vía de señalización mediada por Hog1.

Realizamos un análisis de homología de secuencia de aminoácidos con la proteína Hog1 de T. asahii basado en información genómica de un hongo modelo representativo, Saccharomyces cerevisiae, y hongos patógenos representativos, Aspergillus fumigatus, C. neoformans y C. albicans. La secuencia de aminoácidos de la proteína Hog1 de T. asahii era más del 70% idéntica a la de estos hongos (Fig. 1a y Tabla complementaria S1). La proteína Hog1 de T. asahii contiene un dominio de superfamilia similar a la proteína quinasa c, que incluye un sitio de unión a ATP, un sitio de unión a sustrato polipeptídico y un bucle de activación (Fig. 1b, cy Tabla complementaria S2).

Estimación de la proteína Hog1 en T. asahii y conservación de los aminoácidos entre hongos típicos. (a) El árbol filogenético de T. asahii, C. neoformans, S. cerevisiae, C. albicans Hog1 y A. fumigatus SakA se generó según el método de máxima verosimilitud. (b) Estimación del dominio funcional de T. asahii Hog1 y homólogos. (c) Conservación de los aminoácidos del dominio de la superfamilia similar a la proteína quinasa c en T. asahii Hog1. El sitio de unión de ATP, el sitio de unión del sustrato polipeptídico y el bucle de activación (bucle A) se indican con líneas rojas, verdes y azules, respectivamente.

La cepa deficiente en el gen ku70 de T. asahii MPU129 tiene una alta eficiencia de recombinación homóloga, lo que la hace útil como cepa parental30. Usando esta cepa, generamos el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1. El fragmento de ADN objetivo utilizado para generar el mutante deficiente en el gen hog1 contiene el gen NAT1, que conduce a la resistencia a la nourseotricina (Fig. 2a). Los transformantes con resistencia a nourseotricina se obtuvieron introduciendo el fragmento de ADN mediante electroporación (Fig. 2b). Se extrajo ADN genómico de los transformantes y se confirmó el reemplazo del gen hog1 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Fig. 2c, d). Pueden ocurrir mutaciones genéticas secundarias, como mutaciones puntuales, durante la generación de mutantes con deficiencia genética. Por lo tanto, también generamos una cepa revertida del mutante deficiente en el gen hog1 para confirmar que el fenotipo de la cepa deficiente en el gen se debe a una deficiencia del gen objetivo. El fragmento de ADN objetivo utilizado para generar la cepa revertida del mutante deficiente en el gen hog1 contiene el gen hph, que conduce a la resistencia a la higromicina B (Fig. 2a). Los transformantes con resistencia a la higromicina B se obtuvieron introduciendo el fragmento de ADN mediante electroporación (Fig. 2b). La reintroducción del gen hog1 se verificó mediante PCR utilizando ADN extraído de los transformantes (Fig. 2c, d). Estos resultados confirmaron la generación del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 y el revertente reintroducido en el gen hog1.

Generación del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 y su revertente. ( a – d ) Generación del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 y su revertido. ( a ) Estrategia para generar el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y su revertido (Rev.). Se muestran los genomas previstos del mutante deficiente en el gen hog1 y su revertente. (b) La cepa original (Parent), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y su revertente (Rev.) se propagaron en SDA con nourseotricina (Nou) (100 µg/mL) o higromicina B (Hyg) (100 µg/mL) y se incubaron a 27 °C durante 2 días. (c) Ubicación de los cebadores para confirmar la estructura del genoma del candidato deficiente en el gen hog1 mediante PCR utilizando ADN del genoma extraído. ( d ) Confirmación de los genotipos del mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y su revertido (Rev.) mediante PCR utilizando ADN del genoma extraído. Se utilizaron transferencias recortadas. Las transferencias completas se presentan en la figura complementaria S1.

En C. neoformans y S. cerevisiae, el crecimiento de las cepas deficientes en el gen hog1 se retrasa a 39-40 °C en comparación con sus respectivos padres14,17,35. Examinamos si Hog1 estaba involucrado en la resistencia a altas temperaturas de T. asahii. El crecimiento del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 se retrasó a 40 °C (Fig. 3). Por otro lado, no hubo retraso en el crecimiento del mutante deficiente en el gen hog1 a 27 °C o 37 °C (Fig. 3). El fenotipo sensible a altas temperaturas de los mutantes deficientes en el gen hog1 se suprimió en la cepa revertida (Fig. 3). Estos resultados sugieren que el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 es sensible al estrés por altas temperaturas.

Sensibilidad a la temperatura del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1. (a) La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en SDA y se incubaron a 27 °C durante 1 día. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm. Se prepararon series de diluciones diez veces mayores de la suspensión fúngica utilizando solución salina. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en el SDA. Las placas de agar se incubaron a 27 °C, 37 °C o 40 °C durante 24 h. (b) La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se inocularon en medio Sabouraud y se incubaron a 27 °C, 37 °C. o 40°C. Se controló la absorbancia del cultivo a 630 nm. Los datos se muestran como medias ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de Tukey. *P<0,05.

A continuación, examinamos si Hog1 contribuye a la tolerancia a varios estreses en T. asahii. NaCl, KCl y sorbitol provocan estrés osmótico20,21,22,23,24,36,37. El dodecilsulfato de sodio (SDS) daña la membrana celular35,38,39,40. El rojo Congo y la cafeína provocan daños en la pared celular38,40. El peróxido de hidrógeno (H2O2) induce estrés oxidativo17,19,20,23,41,42. La tunicamicina (TM) y el ditiotreitol (DTT) inducen estrés en el retículo endoplásmico (RE)24,35,43. La exposición a los rayos UV y el metanosulfonato de metilo (MMS) causan daños en el ADN17,35,44. El número de células tolerantes en el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 disminuyó en agar dextrosa Sabouraud (SDA) que contiene SDS, H2O2, menadiona, MMS o tras exposición a los rayos UV, pero no en SDA que contiene NaCl, KCl, sorbitol, cafeína. , rojo Congo, TM o TDT (Fig. 4a-e).

Sensibilidad del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 contra factores estresantes. (a – f) La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en SDA y se incubaron a 27 °C durante 1 día. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica. Se prepararon series de diluciones diez veces mayores de la suspensión fúngica utilizando solución salina. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en el SDA que contenía NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), sorbitol (2 M), SDS (0,008%), cafeína (0,65 mg/ml), rojo Congo (400 µg/ mL), H2O2 (3 mM), menadiona (60 µM), tunicamicina (TM, 1 µg/mL), ditiotreitol (DTT, 12 mM), metanosulfonato de metilo (MMS, 0,05%), anfotericina-B (AMPH-B, 0,4 µg/ml), fluconazol (18 µg/ml) y voriconazol (VRCZ, 0,2 µg/ml). Las células en SDA se expusieron a UV (400 J/m2). Cada placa de agar de (a – d) o (f) se incubó a 27 ° C durante 24 h o 48 h, respectivamente.

La anfotericina B y el fluconazol se utilizan para tratar las infecciones por T. asahii45,46. Los mutantes deficientes en el gen hog1 de C. neoformans y C. albicans son sensibles a un agente antifúngico, la anfotericina B (AMPH-B)19,23,38,42. El mutante deficiente en el gen hog1 de C. albicans es susceptible a los antifúngicos azólicos, mientras que el mutante deficiente en el gen hog1 de C. neoformans es resistente19,23,38,42. El número de células tolerantes en el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 disminuyó en SDA que contenía AMPH-B, fluconazol (FLCZ) o voriconazol (VRCZ) (Fig. 4f). Además, determinamos los valores de CIM de los fármacos antifúngicos para inhibir el crecimiento de la cepa original o del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1. En comparación con la cepa parental, los valores de CIM de AMPH-B, FLCZ, ITCZ y VRCZ fueron más bajos en el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 (Tabla 1). Los fenotipos del mutante deficiente en el gen hog1 se suprimieron en el revertido. Estos hallazgos sugieren que el gen hog1 en T. asahii está involucrado en la resistencia al daño de la membrana celular, el estrés oxidativo, el daño del ADN y los fármacos antifúngicos, como el AMPH-B y los antifúngicos azólicos.

El mutante de T. asahii con deficiencia del gen hog1 no mostró una sensibilidad clara al KCl, NaCl, sorbitol, cafeína, rojo Congo, TM o DTT en condiciones ricas en glucosa. Hog1 en C. neoformans desempeña un papel fundamental en la regulación de las respuestas al estrés en condiciones de restricción de glucosa47. Por lo tanto, investigamos si la deficiencia del gen hog1 en T. asahii causa sensibilidad a estos compuestos en condiciones de restricción de glucosa. En condiciones de restricción de glucosa, el crecimiento del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 se retrasó con NaCl y KCl, pero no con sorbitol, cafeína, rojo Congo, TM o DTT (Fig. 5). Los fenotipos de sensibilidad a NaCl y KCl del mutante deficiente en el gen hog1 se suprimieron en el revertido (Fig. 5). Estos hallazgos sugieren que el gen hog1 en T. asahii contribuye al estrés causado por NaCl y KCl en condiciones de restricción de glucosa.

Efecto de la glucosa sobre la sensibilidad de los mutantes deficientes en el gen hog1 frente a factores estresantes. La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en agar peptona limitado en glucosa y se incubaron a 27 °C durante 1 día. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica. Se prepararon series de diluciones diez veces mayores de la suspensión fúngica utilizando solución salina. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en agar peptona restringido en glucosa que contenía NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), sorbitol (2 M), cafeína (0,65 mg/ml) y rojo Congo (400 µg/ml). , tunicamicina (TM, 1 µg/ml) o ditiotreitol (DTT, 8 mM). Cada placa de agar se incubó a 27 °C durante 48 h.

T. asahii tiene varias formas morfológicas, incluidas levaduras, hifas (forma filamentosa) y artroconidias (cadenas de células y esporas asexuales)4. En C. albicans, Hog1 es un factor clave que regula la formación de hifas20,21,23,25,26,27,28,48. Examinamos si la deficiencia del gen hog1 afecta la formación de hifas en T. asahii. En medio de dextrosa Sabouraud, la proporción de hifas fue mayor en el mutante deficiente en el gen hog1 que en la cepa parental (Fig. 6). Por otro lado, la proporción de levaduras y artroconidias fue menor en el mutante deficiente en el gen hog1 que en la cepa parental (Fig. 6). Las proporciones de hifas por levadura en la cepa parental y en el mutante deficiente en el gen hog1 fueron 0,3 y 2,3, respectivamente. El fenotipo de mayor actividad de formación de hifas en el mutante deficiente en el gen hog1 se suprimió en el revertido (Fig. 6). Estas observaciones sugieren que el gen hog1 regula la formación de hifas por T. asahii.

Efecto de la deficiencia del gen hog1 sobre la morfología de T. asahii en medio de dextrosa Sabouraud. La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en SDA y se incubaron a 27 °C durante 2 días. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm. La absorbancia a 630 nm de la suspensión de células de T. asahii se ajustó a 1. La suspensión de células (10 µl) se añadió a medio de dextrosa Sabouraud (100 µl). Las soluciones se incubaron a 27 °C durante 48 h. La solución incubada se colocó sobre portaobjetos de vidrio y se cubrió con cubreobjetos de vidrio. (a) Las muestras se examinaron con luz brillante bajo un microscopio. Barra de escala, 20 µm. (b) Las imágenes se obtuvieron al azar. Se contaron los números de 3 tipos de células: levadura, artroconidias e hifas.

Examinamos si una deficiencia del gen hog1 reducía la virulencia de T. asahii contra los gusanos de seda. El tiempo de supervivencia de los gusanos de seda inyectados con el mutante deficiente en el gen hog1 fue más largo que el de la cepa parental (Fig. 7a). El valor de LD50 del mutante deficiente en el gen hog1 fue diez veces mayor que el de la cepa original (Fig. 7b y Tabla 2). Este fenotipo fue suprimido en el revertido (Fig. 7 y Tabla 2). Estos hallazgos sugieren que el gen hog1 está implicado en la virulencia de T. asahii contra los gusanos de seda.

Virulencia atenuada del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 contra los gusanos de seda. (a) La cepa parental de T. asahii (Padre; 1,3 × 103 células/larva), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1; 1,6 × 103 células/larva) y el revertido de ∆hog1 (Rev.; 1,1 × 103 células/larva) se inyectaron en la hemolinfa del gusano de seda y los gusanos de seda se incubaron a 37 °C. La supervivencia de los gusanos de seda se controló durante 96 h. La importancia de las diferencias entre el grupo de cepa original y el grupo mutante deficiente en el gen hog1 se calculó mediante la prueba de rango logarítmico basada en las curvas del método de Kaplan-Meier. P <0,05 se consideró significativo. norte = 10/grupo. (b) El número de gusanos de seda supervivientes a 37 °C se determinó 72 h después de la administración de las células fúngicas (1 × 102 a 5,5 × 104 células/larva) en la hemolinfa del gusano de seda. Los gusanos de seda supervivientes y muertos se indican como 1 y 0, respectivamente. norte = 4/grupo. Las curvas se dibujaron a partir de datos combinados de 2 experimentos independientes mediante un modelo de regresión logística simple. El resultado del tiempo letal medio máximo (LT50), que es el tiempo necesario para matar a la mitad de los animales de un grupo, se muestra en la figura complementaria S2.

Examinamos el efecto de la deficiencia del gen hog1 sobre la viabilidad de las células de T. asahii en hemolinfa de gusanos de seda recolectados in vitro. En la cepa original, la cantidad de células viables en la hemolinfa del gusano de seda aumentó después de la incubación (Fig. 8a). Por otro lado, el número de células viables del mutante deficiente en el gen hog1 disminuyó en la hemolinfa del gusano de seda después de 96 h de incubación (Fig. 8a). El número de células viables del mutante deficiente en el gen hog1 en la hemolinfa del gusano de seda después de 96 h de incubación fue menor que el de la cepa parental (Fig. 8b). En la hemolinfa del gusano de seda, la proporción de hifas fue mayor en el mutante deficiente en el gen hog1 que en la cepa parental (Fig. 9). Los fenotipos de mayor actividad de formación de hifas en el mutante deficiente en el gen hog1 se suprimieron en el revertido (Figs. 8 y 9). Esta observación sugiere que el gen hog1 está involucrado en los cambios morfológicos de T. asahii en la hemolinfa del gusano de seda y en la tolerancia contra los factores de la hemolinfa del gusano de seda.

Disminución del número de células viables del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 en hemolinfa de gusano de seda recolectada. La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en SDA y se incubaron a 27 °C durante 1 día. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm. La absorbancia a 630 nm de la suspensión de células T. asahii se ajustó a 1–1,5. La suspensión celular (10 µl) se añadió a la hemolinfa del gusano de seda recolectada (90 µl) y las soluciones se incubaron a 37 °C durante 4 días. Las células viables de T. asahii se determinaron mediante el método CFU. (a) Experimento del curso del tiempo. norte = 3/grupo. Las diferencias estadísticamente significativas entre 0 y 4 días se evaluaron mediante la prueba t de Student. *P<0,05. (b) Las células viables de T. asahii se determinaron 4 días después de la inoculación. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de Tukey. *P<0,05.

Papel del gen hog1 en el cambio morfológico de T. asahii en la hemolinfa del gusano de seda. La cepa parental de T. asahii (Padre), el mutante deficiente en el gen hog1 (∆hog1) y el revertido de ∆hog1 (Rev.) se cultivaron en SDA y se incubaron a 27 °C durante 2 días. Se suspendieron células de T. asahii en solución salina fisiológica y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm. La absorbancia a 630 nm de la suspensión de células de T. asahii se ajustó a 1. La suspensión de células (10 µl) se añadió a hemolinfa (100 µl). Las soluciones se incubaron a 27 °C durante 48 h. La solución incubada se colocó sobre portaobjetos de vidrio y se cubrió con cubreobjetos de vidrio. (a) Las muestras se examinaron con luz brillante bajo un microscopio. Barra de escala, 20 µm. (b) Las imágenes se obtuvieron al azar. Se contaron los números de 3 tipos de células: levadura, artroconidias e hifas.

En el presente estudio, generamos un mutante de T. asahii deficiente en el gen hog1 para examinar su papel del gen hog1 en la tolerancia al estrés y la virulencia. El gen hog1 en T. asahii desempeña un papel vital en la tolerancia al estrés a altas temperaturas, agentes oxidativos, fármacos antimicóticos y factores de la hemolinfa del gusano de seda. Nuestros hallazgos sugieren que la tolerancia al estrés de T. asahii está regulada por la vía de señalización mediada por Hog1 y que la tolerancia al estrés de T. asahii podría contribuir a su virulencia.

Hog1 es una MAPK que está ampliamente conservada en hongos16,49. En hongos como S. cerevisiae y C. neoformans, la vía de señalización mediada por Hog1 participa en la resistencia a diversos factores estresantes15,16. En el genoma de T. asahii se identificó un gen que codifica una proteína con más del 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de Hog1 en S. cerevisiae y C. neoformans. Además, la proteína Hog1 en T. asahii contiene un dominio de fosforilación. Por lo tanto, asumimos que Hog1 también está involucrado en la cascada de quinasas relacionada con las respuestas al estrés en T. asahii.

El gen hog1 es necesario para el crecimiento normal de T. asahii en condiciones de alta temperatura (40 °C). Se observó una inhibición grave del crecimiento del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 a 40 °C en comparación con 27 °C y 37 °C. Por lo tanto, la respuesta al estrés por altas temperaturas en T. asahii está mediada por Hog1. En C. neoformans y S. cerevisiae, la vía de señalización mediada por Hog1 es necesaria para el crecimiento a 40 °C14,17,35. S. cerevisiae Hog1 se activa con altas temperaturas y es necesario para la recuperación inmediata de condiciones de altas temperaturas14. Además, el estrés por altas temperaturas activa simultáneamente Hog1 y la vía de integridad de la pared celular en S. cerevisiae50. En Candida albicans, Hog1 regula la vía de integridad de la pared celular51. La eliminación del gen CEL1, que codifica una polisacárido monooxigenasa lítica implicada en la integridad de la pared celular en Cryptococcus neoformans, provoca susceptibilidad al estrés por altas temperaturas52. Por lo tanto, asumimos que Hog1 en T. asahii puede activarse por el estrés por altas temperaturas y regula la vía de integridad de la pared celular para la tolerancia al estrés por altas temperaturas.

Hog1 es necesario para varios tipos diferentes de respuestas al estrés en T. asahii. Hog1 en S. cerevisiae y C. albicans, y SakA en A. fumigatus desempeñan funciones importantes en las respuestas al estrés osmótico20,21,22,23,24,36,37. En C. neoformans, Hog1 es necesario para la resistencia al estrés causado por NaCl y KCl en condiciones de restricción de glucosa19,47. En T. asahii, Hog1 no participa en las respuestas al estrés osmótico en condiciones ricas en glucosa. Por otro lado, Hog1 en T. asahii está relacionado con la resistencia a NaCl y KCl en condiciones de restricción de glucosa. Los fenotipos de T. asahii son similares a los de C. neoformans. Aguas arriba de la vía de señalización Hog1 MAPK en S. cerevisiae hay dos cascadas ramificadas que consisten en Sho1 o Sln1, que fosforilan la quinasa quinasa Pbs2 MAPK14,15. Sin embargo, el gen que codifica el homólogo Sln1 de S. cerevisiae no está presente en el genoma de C. neoformans y la histidina quinasa Tco2, en lugar de Sln1, actúa como sensor osmótico15,19,53. La histidina quinasa en T. asahii tiene una homología de secuencia de aminoácidos del 46% con C. neoformans Tco2. Además, ninguna proteína en T. asahii tiene al menos un 30% de homología de secuencia de aminoácidos con el sensor osmótico Sho1 en S. cerevisiae. Por lo tanto, T. asahii puede tener un mecanismo de respuesta al estrés osmótico mediado por Tco2 similar al de C. neoformans. En C. neoformans, Ena1, una Na+/ATPasa regulada por Hog1, exporta cationes como iones de sodio y potasio47,54. El mutante de C. neoformans deficiente en el gen ena1 exhibe un crecimiento similar al de la cepa de tipo salvaje bajo estrés inducido por NaCl y KCl en condiciones ricas en glucosa, pero muestra susceptibilidad en condiciones bajas en glucosa47,54. En T. asahii, Hog1 puede regular el mecanismo de tolerancia al estrés para los iones de sodio y potasio mediado por Ena1 en condiciones de bajo contenido de glucosa. Se necesitan más estudios para aclarar las relaciones entre Hog1 y Tco2 o Ena1 en la respuesta al estrés catiónico de T. asahii. Hog1 en C. neoformans y SakA, un homólogo de Hog1, en A. fumigatus muestran susceptibilidad a compuestos que causan daño a la membrana celular35,39,40. SakA en A. fumigatus es necesaria para la vía de señalización de la integridad de la pared celular y contribuye a la resistencia contra el daño de la pared celular39. Por otro lado, debido a que la vía de señalización Hog1 y la vía de señalización de la integridad de la pared celular no están asociadas en C. neoformans, el mutante deficiente en el gen hog1 no muestra una marcada susceptibilidad al estrés de la pared celular38,40. En T. asahii, Hog1 contribuye a la tolerancia al daño de la membrana celular, pero no al daño de la pared celular. Por tanto, la función de Hog1 en T. asahii para el mantenimiento de las membranas y paredes celulares es similar a la de C. neoformans. En C. neoformans, C. albicans y S. cerevisiae, Hog1 desempeña un papel crucial en la resistencia al estrés oxidativo y al estrés del RE17,20,23,24,35,41,42,43. El mutante de T. asahii con deficiencia del gen hog1 mostró sensibilidad al estrés oxidativo, pero no al estrés del RE. Estas observaciones sugieren que Hog1 en T. asahii es un factor esencial para la resistencia al estrés oxidativo, y que T. asahii posee un mecanismo que involucra la resistencia al estrés oxidativo mediada por Hog1 similar a otros hongos como C. neoformans. Hog1 en C. neoformans regula la expresión de factores relacionados con el estrés oxidativo, como la catalasa y la superóxido dismutasa de manganeso mitocondrial54. La mayor sensibilidad al H2O2 y la menadiona observada en el mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 puede deberse a una disminución en la actividad de las enzimas involucradas en la eliminación de especies reactivas de oxígeno. La identificación de las enzimas responsables reguladas por Hog1 para eliminar las especies reactivas de oxígeno en T. asahii será un objetivo importante de investigación futura. Hog1 en C. neoformans y S. cerevisiae contribuye a la resistencia al daño del ADN17,35,44. La sensibilidad del mutante T. asahii deficiente en el gen hog1 contra MMS y UV sugiere que Hog1 es un factor esencial para la resistencia a las mutaciones del ADN en T. asahii. Supusimos que Hog1 en T. asahii se fosforila tras la exposición a estos factores estresantes. El desarrollo de un anticuerpo específico contra T. asahii Hog1 es importante para revelar los mecanismos de respuesta al estrés mediante fosforilación.

T. asahii exhibe resistencia mediada por Hog1 a los fármacos antimicóticos. El mutante deficiente en el gen hog1 en C. albicans muestra sensibilidad a AMPH-B y a los fármacos antifúngicos azólicos23. En C. neoformans, el mutante deficiente en el gen hog1 muestra sensibilidad a AMPH-B, pero no a los fármacos antimicóticos azólicos19,35,38. Hog1 en T. asahii participa en la resistencia a los fármacos antifúngicos. El uso combinado de inhibidores de Hog1 y agentes antifúngicos AMPH-B o azólicos podría ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por T. asahii.

C. albicans exhibe 2 formas de levadura e hifas, y el alargamiento de las hifas está regulado negativamente por Hog120,21,23,25,26,27,28,48. Debido a que el mutante de T. asahii deficiente en el gen hog1 forma más hifas que la cepa original, Hog1 podría regular la formación de hifas en T. asahii. Nuestra hipótesis es que Hog1 en T. asahii controla la expresión de genes relacionados con la formación de hifas. La formación de hifas en T. asahii es inducida por magnesio55. En C. albicans, la deficiencia de magnesio activa Hog156. Por tanto, el magnesio juega un papel importante en la regulación de la activación de Hog1 en hongos. En T. asahii, el magnesio puede suprimir la vía Hog1 y promover la formación de hifas que es similar al fenotipo del mutante deficiente en el gen hog1. Identificar los genes importantes implicados en la formación de hifas regulada por Hog1 es un importante desafío futuro para profundizar nuestra comprensión de los aspectos morfológicos de T. asahii.

La virulencia de T. asahii contra los gusanos de seda se vio reducida por la deficiencia del gen hog1. Además, el número de células viables en el mutante deficiente en el gen hog1 disminuyó en la hemolinfa del gusano de seda. Especulamos que la deficiencia del gen hog1 causa varias sensibilidades al estrés en el entorno del huésped y da como resultado un fenotipo virulento en T. asahii. Por lo tanto, la identificación de los factores del huésped que inducen respuestas de estrés mediadas por Hog1 es un tema importante para futuras investigaciones.

Los inhibidores de Hog1 pueden atenuar la virulencia de T. asahii. Sin embargo, estos inhibidores pueden afectar a los humanos porque Hog1 está altamente conservado entre los eucariotas. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de inhibidores fúngicos específicos de Hog1. En la calcineurina, que está altamente conservada en eucariotas como Hog1, se ha sintetizado un inhibidor de calcineurina específico de hongos centrándose en las sutiles diferencias estructurales entre la calcineurina humana y la calcineurina fúngica57. Supusimos que podría ser posible construir compuestos inhibidores selectivos para el hongo Hog1 en función de diferencias estructurales, similar al desarrollo de compuestos inhibidores de la calcineurina.

En conclusión, T. asahii controla la respuesta al estrés y la virulencia a través de Hog1. Las respuestas al estrés mediadas por Hog1 podrían contribuir a la resistencia a los fármacos antifúngicos y la virulencia de T. asahii al facilitar su adaptación a los entornos del huésped. Estos hallazgos sugieren que los inhibidores de Hog1, como agentes antiinfecciosos en combinación con fármacos antimicóticos, pueden ser útiles en el tratamiento de la infección por T. asahii.

La nourseotricina se adquirió de Jena Bioscience (Dortmund, Alemania). Cefotaxima sódica, D-glucosa, agar, NaCl, KCl, sorbitol, H2O2, DTT, MMS y AMPH-B se adquirieron de Fujifilm Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japón). La higromicina B, la cafeína, FLCZ, VRCZ y N-feniltiourea se adquirieron de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japón). Congo Red y menadiona se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). G418 se adquirió de Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, EE. UU.). La hipolipeptona se adquirió de Nihon Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japón). Tunicamicina (TM) se adquirió de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE. UU.). El dodecilsulfato de sodio (SDS) se adquirió de Nippon Gene Co., Ltd. (Tokio, Japón). Tween 80 se adquirió de MP Biomedicals LLC (Santa Ana, MO, EE. UU.).

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas Hog1 en T. asahii, C. neoformans, C. albicans y S. cerevisiae, y la proteína SakA en A. fumigatus se obtuvieron de Ensembl Fungi (http://fungi.ensembl.org/index .html). Las ID de los genes Ensembl Fungi de las proteínas se muestran en la Tabla complementaria 1. Los dominios funcionales de las proteínas se estimaron en el sitio web del NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov). Los números de acceso al dominio NCBI de las proteínas se muestran en la Tabla complementaria 2. El árbol filogénico se construyó de acuerdo con el método de máxima verosimilitud utilizando el software MEGA11 (https://www.megasoftware.net/). La alineación de la secuencia de aminoácidos se realizó utilizando el software MEGA11.

La cepa de T. asahii (mutante con deficiencia del gen MPU129 ku70) utilizada en este estudio se generó como se informó anteriormente30. El mutante con deficiencia del gen T. asahii MPU129 ku70 se cultivó en SDA (1 % de hipolipeptona, 4 % de dextrosa y 1,5 % de agar) que contenía G418 (100 μg/ml) y se incubó a 27 °C durante 2 días.

El plásmido para cepas de T. asahii con genes deficientes se construyó según un informe anterior34. Para generar la cepa deficiente en el gen hog1, se introdujeron la 5′-UTR y la 3′-UTR del gen hog1 en un vector pAg1-NAT1 utilizando el método de infusión (In-Fusion HD Cloning Kit, Takara, Shiga, Japón). Para generar el revertido, el casete del gen de higromicina fosfotransferasa (hph) y el gen hog1 se introdujeron en pAg1-hog1 (5'UTR) -NAT1-hog1 (3'UTR). Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR de cada región de ADN se muestran en la Tabla complementaria 3.

La transferencia de genes mediante electroporación se realizó según un informe anterior33. Los fragmentos 5′-UTR (hog1)-NAT1-3′-UTR (hog1) o 5′-UTR (hog1)-hog1-hph-3′-UTR (hog1) se amplificaron mediante PCR con los cebadores que se muestran en la tabla complementaria. 3. Las células competentes de T. asahii (40 µL) con los fragmentos de ADN (90–180 ng) se agregaron a una cubeta con un espacio de 0,2 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc.) y se electroporaron (protocolo de constante de tiempo: 1800 V, 5 ms) usando un Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Las células se suspendieron en peptona dextrosa de levadura que contenía sorbitol 0,6 M y se incubaron a 27 °C durante 3 h. Después de la incubación, las células se aplicaron a SDA que contenía nourseotricina (300 µg/ml) o higromicina B (300 µg/ml) y se incubaron a 27 °C durante 3 días. La mutación en el genoma de los candidatos que crecen en los medicamentos que contienen SDA se confirmó mediante PCR con los cebadores que se muestran en la Tabla complementaria 3. La información sobre las cepas se proporciona en la Tabla 3.

La prueba de sensibilidad a la temperatura se realizó según un informe anterior con ligeras modificaciones34. Las células de T. asahii cultivadas en SDA que contenía cefotaxima (100 μg/ml) a 27 °C durante 1 día se suspendieron en solución salina fisiológica con Tween 80 al 0,01 % y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm (Corning Inc., Corning, EE.UU.). Nueva York, Estados Unidos). La suspensión de células de T. asahii se ajustó a 1–1,2 en absorbancia a 630 nm. Se prepararon series de una dilución diez veces mayor de la suspensión fúngica usando solución salina. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en el SDA. Las placas de agar se incubaron a 27, 37 o 40 °C durante 48 h y se obtuvieron fotografías.

Para el crecimiento en medio líquido, en este estudio se utilizó medio líquido Sabouraud (1% hipolipeptona, 4% dextrosa). Se prepararon suspensiones celulares de las cepas de T. asahii con medio líquido Sabouraud. Las suspensiones de T. asahii (A630 = 0,005) se incubaron a 27 °C, 37 °C o 40 °C durante 4 días y se midió la absorbancia a 630 nm utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas iMark; Bio-Rad Laboratories Inc. , Hércules, California, EE. UU.).

La prueba de sensibilidad al fármaco se realizó según informe anterior con ligeras modificaciones34. Se prepararon series de una dilución diez veces mayor de la suspensión fúngica de la misma manera que para la prueba de sensibilidad a la temperatura descrita anteriormente. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en el SDA que contenía NaCl (1,2 M), KCl (1,5 M), cafeína (0,65 mg/mL), rojo Congo (400 µg/mL), SDS (0,008%), H2O2 (3 mM), menadiona (60 µM), TM (1 µg/mL), DTT (12 mM), MMS (0,05%), AMPH-B (0,4 µg/mL), FLCZ (18 µg/mL) o VRCZ ( 0,2 µg/ml). Cada placa de agar se incubó a 27 °C durante 24 a 48 h y se obtuvieron fotografías.

Se prepararon series de una dilución diez veces mayor de la suspensión fúngica de la misma manera que para la prueba de sensibilidad a la temperatura descrita anteriormente. Se colocaron cinco microlitros de cada suspensión celular en el SDA. La placa SDA se expuso a luz ultravioleta utilizando un reticulante UV (CX-2000; UVP LLC, Upland, EE. UU.). Cada placa de agar se incubó a 27 °C durante 24 h y se obtuvieron fotografías.

Los valores de CIM se determinaron mediante un método de dilución de microlíquidos (CLSI, M27-A3) utilizando placas de prueba de susceptibilidad antifúngica (hongo similar a la levadura DP 'Eiken'; Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón)58. Las células de T. asahii en SDA que contenían cefotaxima (100 µg/ml) se suspendieron en solución salina fisiológica con Tween 80 al 0,01 %. La suspensión de células de T. asahii se ajustó a McFarland 1. Cada suspensión fúngica se diluyó 20 veces en solución salina. y luego se diluyó 100 veces en medio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, EE. UU.) que contenía MOPS 0,165 M (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón) (RPMI MOPS) (pH 7,0). Se aplicaron cien microlitros de cada suspensión celular a los pocillos de las placas de prueba de susceptibilidad antifúngica. Las placas de prueba se incubaron a 37 °C durante 48 h. Los valores de MIC se determinaron a partir de los resultados de dos experimentos independientes.

La observación de la morfología se realizó según informe previo34. Las células de T. asahii se suspendieron en solución salina fisiológica con Tween 80 al 0,01% y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm (Corning Inc.). La suspensión celular (10 µl) ajustada a 1 en absorbancia a 630 nm se añadió a medio líquido de dextrosa Sabouraud (90 µl) o hemolinfa de gusano de seda recolectada (90 µl). La solución incubada a 27 °C durante 48 h se colocó en portaobjetos de vidrio y se cubrió con cubreobjetos de vidrio. Las muestras se examinaron con luz brillante bajo un microscopio (CH-30; Olympus, Tokio, Japón). Las imágenes fueron obtenidas al azar. La morfología de T. asahii se determinó según un informe previo59. Se contaron los números de los siguientes 3 tipos de células: levadura (células esféricas que incluyen levaduras en ciernes y pueden incluir blastoconidias); artroconidios (≥ 3 células redondas o rectangulares conectadas con sus interiores separados por septos); e hifas (células alargadas hasta una longitud de al menos 2 células de levadura que no poseen septos).

Los experimentos de infección por gusanos de seda se realizaron según un informe anterior con ligeras modificaciones30. Se adquirieron huevos de gusanos de seda (Hu·Yo × Tukuba·Ne) de Ehime-Sanshu Co, Ltd. (Ehime, Japón). Las larvas del quinto estadio del gusano de seda se alimentaron con una dieta artificial (Silkmate 2S; Ehime-Sanshu Co., Ltd.) durante la noche. La T. asahii cultivada en placas SDA incubadas durante 1 día a 27 °C se suspendió en solución salina fisiológica con Tween 80 al 0,01 % y se filtró a través de un filtro celular de 40 μm (Corning Inc.). Se administró a los gusanos de seda una suspensión de 50 µl de células de T. asahii y los gusanos de seda inyectados con células de T. asahii se incubaron a 37 °C.

La dosis de T. asahii necesaria para matar la mitad de los gusanos de seda (LD50) se determinó según un informe anterior con ligeras modificaciones. Se inyectaron cepas de T. asahii (1 × 102 a 5,5 × 104 células/50 µL) en la hemolinfa del gusano de seda y Los gusanos de seda se incubaron a 37 °C. Se registró la supervivencia de los gusanos de seda (n = 4/grupo) a las 72 h. La LD50 se determinó a partir de los datos combinados de 2 experimentos independientes mediante un modelo de regresión logística simple utilizando Prism 9.1.2 (GraphPad Software, LLC, San Diego, CA, EE. UU., https://www.graphpad.com/scientific-software/ prisma/).

Las células de T. asahii cultivadas en SDA que contenía cefotaxima (100 μg/ml) se suspendieron en solución salina fisiológica con Tween 80 al 0,01 % y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm (Corning Inc.). Se agregaron diez microlitros de cada suspensión celular (A630 = 1–1,5) a 90 µl de hemolinfa de gusano de seda esterilizada con filtro. Las suspensiones celulares se cultivaron a 37 °C durante 4 días y se recogieron cada 24 h. Las suspensiones de células recolectadas se diluyeron 2000 veces con solución salina fisiológica y se esparcieron 100 µl sobre SDA. Se contó el número de colonias en el SDA después de 1 día de incubación.

Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces y se muestran resultados representativos. La importancia de las diferencias entre grupos en los experimentos de infección por gusanos de seda en la Fig. 7a se calculó mediante la prueba de rango logarítmico basada en curvas determinadas utilizando el método de Kaplan-Meier con Prism 9.1.2. P <0,05 se consideró significativo. Las diferencias estadísticamente significativas entre 0 y 4 días en la Fig. 8a se evaluaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de la Fig. 8b se evaluaron mediante la prueba de Tukey.

Los conjuntos de datos generados en el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a Eri Sato, Hiromi Kanai y Sachi Koganesawa (Universidad Farmacéutica Meiji) por su asistencia técnica en la cría de gusanos de seda. Este estudio fue apoyado por la subvención JSPS KAKENHI número JP20K07022 y JP23K06141 (Investigación científica (C) para YM) y en parte por el Programa de investigación sobre enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico, AMED (Número de subvención JP20fk0108135h0201 y 23fk0108679h0401 a TS).

Estos autores contribuyeron por igual: Yasuhiko Matsumoto y Yu Sugiyama.

Departamento de Microbiología, Universidad Farmacéutica Meiji, 2-522-1, Noshio, Kiyose, Tokio, 204-8588, Japón

Yasuhiko Matsumoto, Yu Sugiyama, Tae Nagamachi, Asami Yoshikawa y Takashi Sugita

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Concepción y diseño del estudio: YM, YS Adquisición de datos: YM, YS Análisis e interpretación de datos: YM, YS, TN, AY Redacción del manuscrito: YM, YS Revisión crítica: YM, TN, AY, TS Todos los autores han leído y aprobó la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Yasuhiko Matsumoto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Matsumoto, Y., Sugiyama, Y., Nagamachi, T. et al. Tolerancia al estrés mediada por Hog1 en el hongo patógeno Trichosporon asahii. Representante científico 13, 13539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40825-y

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Recibido: 05 de junio de 2023

Aceptado: 17 de agosto de 2023

Publicado: 19 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40825-y

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